َمحیط کشت سلول : که ماده پایه و ضروری برای انجام کارهای کشت میباشد.محیط کشت ، مواد غذایی لازم جهت رشد و بقای سلول را فراهم کرده و ازطرفی نیازهایی از سلول که بر پایه خصوصیات فیزیو شیمیایی آن است از جمله اسمولاریته، pH و… رافراهم میکند.بطور کلی محیطهای کشت سلولی دارای اسید آمینه های ضروری، نمک های آلی و غیر آلی، ویتامینها ، فلزات، قند، چربی و اسیدهای نوکلئیک هستند.از طرفی محیط کشت یک محیط پایدار از لحاظ اسیدی و بازی بودن برای سلول فراهم میکند تا آلودگی های مختلف نتواند جلوی رشد سلول را بگیرد.
انواع محیط های کشت کاربردی در کشت سلول DMEM,MEM و RPMI-1640 است.
انتخاب هرکدام از این محیط کشت ها برای کاربر بستگی به به نوع cell line و شرایط آزمایشگاه دارد .
محیط کشت DMEM محیط روتین است و برای اکثر سلولها استفاده میشود.
برای سلولهایی که کشت آنها برای اولین بار بررسی می شود بهتر است به مقالات معتبر ارجاع شود .
انواع محیط های کشت کاربردی DMEM:
DMEM محیط کشت پایه برای رشد بسیاری از سلولها مانند فیبروبلاست اولیه , سلول های عصبی , گلیال , عضلانی و سلول های سرطانی است.
این محیط کشت همان محیط کشت پایه MEM که از مجموعه ای از اسیدهای آمینه ، ویتامین ها ، نمک های معدنی ، گلوکز و سرم به عنوان منبع رشد و هورمون ها تشکیل شده است.
غلظت گلوکز در محیط های کشت از 5.5 میکرومولار تا 25 میکرومولار متغیر است.
علاوه بر مواد مغذی ، این ماده به دلیل داشتن فنل رد به حفظ pH و اسمولالیته نیز کمک می کند و pH آن در حدود 7.4 است .
طبقه بندی انواع محیط های کشت کاربردی بر اساس میزان گلوکز , فنل رد و l-glutamin صورت می گیرد
گلوکز:
فرمولاسیون پایه DMEM به صورت (low glucose 1 g/l) است.
ولی اغلب به صورت (high glucose 4.5 g/l) استفاده می شود وبه دو گروه تقسیم میشود.
DMEM, high glucose,no glutamine
DMEM, low glucose,no glutamine
کاربرد محیط های کشت DMEM در کشت سلول هایی است مانند cancer cell line ,HEK 293 T cells
فنل رد:
به بسیاری از محیطهای کشت سلولها برای نشان دادن pH ، فنول رد اضافه میشود که رنگ محیط کشت را قرمز میکند. فنل رد شباهت ساختاری با هورمون های استروییدی مانند استروژن دارد.
در آزمایش هایی که اثر گیرنده های استروژنی بررسی می شود از محیط کشت بدون فنل رد استفاده می شود.
With phenol red
Without phenol red
L-glutamin:
یکی از منابع اصلی انرژی در سلول هایی است که به سرعت تکثیر می شوند و میزان انرژی کربوهیدرات در محیط کافی نیست.
محدودیت های آن عبارتند از ناپایداری در محلول , تجزیه آن به آمونیاک که برای سلول سمی است.
برای غلبه بر این مشکلات گلوتامین به فرم گلوتامات به محیط اضافه میشود.
L-Glutamin
Glutamin-Free
Stable Glutamin
محیط کشت DMEM+Glutamax:
Glutamax فرم L- Alanyl-L-glutamine است و مانع جمع شدن آمونیاک در سلول می شود.
محیط کشت IMDM:
فرم اصلاح یافته DMEM است و در مقایسه با آن مواد مغذی بیشتری دارد.
محیط کشت Non essential amino acid )MEM NEAA) :
این محیط کشت شامل هفت آمینو اسید غیر ضروری است که برای رشد بهینه سلول استفاده می شود.
اکثر سلولها اسیدهای امینه غیر ضروری را از طریق چرخه کربس و گلیکولیز تولید میکنند.
کاهش این امینو اسیدهای غیر ضروری در محیط کشت منجر به تولید فراورده های جانبی به دلیل مصرف بیشتر گلوکز و گلوتامین می گردد و در رشد سلول تاثیر میگذارد .
محیط کشت RPMI 1640 :
محیط کشت مناسب برای رشد سلولهای لنفوسیت و مونوسیت های خون محیطی است.
دارای میزان بالایی گلوتاتیون , ویتامین های بیوتین , B12 و aminobenzoic acid PABA است که در محیط های کشت DMEM و MEM وجود ندارد.
محیط کشت بسیار غنی شده برای تکثیر و تراکم بالای سلولها ست .
محیط کشت RPMI 1640 فرم اصلاح یافته DMEM است و در مقایسه با آن اسیدهای آمینه ، ویتامین ها و نمک های معدنی بیشتری دارد .
دارای نیترات پتاسیم به جای نیترات آهن و ترکیبات HEPES و سدیم پیروات است.
بافرهای آلی و غیر آلی: تنظیم بودن pH محیط کشت یکی از مهمترین فاکتورها در محیط برای رشد خوب سلولهاست. سلول ها در حین رشد مواد اسیدی متابولیکی از خود تولید میکنند که محیط را مناسب رشد باکتری مینماید ازین رو اضافه کردن بافرهای مناسب به محیط برای حفظ و کنترل pH محیط ضروری است.
یکی از بافرهای غیر آلی استفاده شده در محیط کشت ، بیکربنات سدیم است. این بافر ارزان بوده و معمولا برای حفظ محدوده بافری از آن استفاده میشود. زمانی که نیاز به pH بالاتر داشته باشیم یا بخواهیم pH محیط را ثابت نگه داریم از HEPES استفاده میشود که یک ماده آلی دوقطبی است و محدوده pH را بین 7.2 -7.6 نگه میدارد. البته لازم به ذکر است که برخی سلول ها نسبت به این ماده حساس میباشند ؛ بنابراین مقدار HEPES اضافه شده به محیط بسیار حایز اهمیت است.
سرم جنین گاوی: استفاده کردن از مکملهای رشد در محیط کشت در فراهم کردن فاکتورهای رشد و هورمونها ، خنثی کردن مواد سمی، حفاظت کردن سلول از استرس های فیزیکی و از بین رفتن آن موثر است.
سرم جنین گاوی از لحاظ دارا بودن فاکتوهای مناسب رشد بسیار غنی است که میتواند بین رشد و مرگ سلول تعادل ایجادکند. مبنع سرم جنین گاوی پلاسمای خون میباشد که به دلیل داشتن فاکتورهای رشد بیشتر و ایمنوگلوبین های کمتر نسبت به سایر مکملها مثل سرم گاو ، اسب و….رایج تر و البته گران تر میباشد.
آنتی بیوتیک ها: محیط کشت های سلولی بسیار مغذی هستند که بسیار مطلوب رشد انواع باکتری ها میباشند. به این دلیل عموما به محیط کشت های ساخته شده مقدار مشخصی آنتی بیوتیک ضد باکتری پنی سیلین و استرپتومایسین اضافه میشود که که با مهار تولید دیواره باکتری و پروتین سازی باعث از بین رفتن طیف وسیعی از باکتری های گرم مثبت و منفی میشوند. گاهی به دلیل گرم و مرطوب بودن فضای داخل انکوباتورها رشد قارچ دیده میشود که با انتی بیوتیک های ضد قارچ مانند آمفوتریسین B میتوان این مشکل را حل کرد.
فسفات بافر سالین: یا همان PBS که در کارهای مرتبط با کشت سلول با داشتن pH فیزیولوژیک، به عنوان یک بافر استاندارد جهت شستشوی سلولها و رقتسازی انواع محلولها استفاده میشود.
آنزیم تریپسین: برای جداکردن سلولها از هم در بافت یا از سطح ظرفی که کشت داده شده استفاده میشود
آخرین دیدگاهها