آوریل 25, 2025 | اخبار و مقالات
زیستشناسی مولکولی، مطالعه زیستشناسی در سطح مولکولی و به معنای علم استنباط برهمکنشهای مولکولیِ فعالیتهای زیستی در بین سامانههای مختلف درونسلولی است که شامل ارتباطات میان RNA ، DNA، پروتئین و بیوسنتز آنها میباشد. بهعلاوه، چگونگی تنظیم این برهمکشها نیز مورد بررسی قرار میگیرد.
زیستشناسی سلولی، شاخه جدیدی از دانش زیستشناسی است که به ساختار و کارکرد یاخته ها در مقیاس مولکولی میپردازد. در این شاخه از زیستشناسی بیشتر در مورد برهمکنش ملکولهای زیستی با یکدیگر در سلول و اینکه چگونه این برهمکنشها باعث میشوند که یک سلول بتواند به خوبی کارکرد داشته باشد بررسی میشود.
زیستشناسی سلولی و ملکولی هم پوشانی زیادی با ژنتیک مولکولی و بیوشیمی دارد و گاهی نمی توان میان آن ها مرز مشخصی قرار داد. پژوهشهای بالینی و درمانهای پزشکی که بر پایهٔ زیستشناسی مولکولی هستند تا حدودی به وسیلهٔ ژن درمانی پوشش داده شدهاند. اکنون، بهکارگیری زیستشناسی مولکولی یا روشها و ابزارهای زیستشناسی سلولی مولکولی در پزشکی به عنوان پزشکی مولکولی شناخته میشود. همچنین زیستشناسی مولکولی نقش مهمی در درک شکلگیری، فعالیت و تنظیم بخشهای مختلف یک سلول ایفا میکند که میتواند برای تعیین دقیق اهداف داروهای جدید، تشخیص بیماریها و درک فیزیولوژی سلول مورد استفاده قرار گیرد.
تعدادی از روشهای آزمایشگاهی مورد استفاده در زیست شناسی مولکولی عبارتند از؛
روش لکه شرقی
آگوست 31, 2020 | اخبار و مقالات
َمحیط کشت سلول : که ماده پایه و ضروری برای انجام کارهای کشت میباشد.محیط کشت ، مواد غذایی لازم جهت رشد و بقای سلول را فراهم کرده و ازطرفی نیازهایی از سلول که بر پایه خصوصیات فیزیو شیمیایی آن است از جمله اسمولاریته، pH و… رافراهم میکند.بطور کلی محیطهای کشت سلولی دارای اسید آمینه های ضروری، نمک های آلی و غیر آلی، ویتامینها ، فلزات، قند، چربی و اسیدهای نوکلئیک هستند.از طرفی محیط کشت یک محیط پایدار از لحاظ اسیدی و بازی بودن برای سلول فراهم میکند تا آلودگی های مختلف نتواند جلوی رشد سلول را بگیرد.
انواع محیط های کشت کاربردی در کشت سلول DMEM,MEM و RPMI-1640 است.
انتخاب هرکدام از این محیط کشت ها برای کاربر بستگی به به نوع cell line و شرایط آزمایشگاه دارد .
محیط کشت DMEM محیط روتین است و برای اکثر سلولها استفاده میشود.
برای سلولهایی که کشت آنها برای اولین بار بررسی می شود بهتر است به مقالات معتبر ارجاع شود .
انواع محیط های کشت کاربردی DMEM:
DMEM محیط کشت پایه برای رشد بسیاری از سلولها مانند فیبروبلاست اولیه , سلول های عصبی , گلیال , عضلانی و سلول های سرطانی است.
این محیط کشت همان محیط کشت پایه MEM که از مجموعه ای از اسیدهای آمینه ، ویتامین ها ، نمک های معدنی ، گلوکز و سرم به عنوان منبع رشد و هورمون ها تشکیل شده است.
غلظت گلوکز در محیط های کشت از 5.5 میکرومولار تا 25 میکرومولار متغیر است.
علاوه بر مواد مغذی ، این ماده به دلیل داشتن فنل رد به حفظ pH و اسمولالیته نیز کمک می کند و pH آن در حدود 7.4 است .
طبقه بندی انواع محیط های کشت کاربردی بر اساس میزان گلوکز , فنل رد و l-glutamin صورت می گیرد
گلوکز:
فرمولاسیون پایه DMEM به صورت (low glucose 1 g/l) است.
ولی اغلب به صورت (high glucose 4.5 g/l) استفاده می شود وبه دو گروه تقسیم میشود.
DMEM, high glucose,no glutamine
DMEM, low glucose,no glutamine
کاربرد محیط های کشت DMEM در کشت سلول هایی است مانند cancer cell line ,HEK 293 T cells
فنل رد:
به بسیاری از محیطهای کشت سلولها برای نشان دادن pH ، فنول رد اضافه میشود که رنگ محیط کشت را قرمز میکند. فنل رد شباهت ساختاری با هورمون های استروییدی مانند استروژن دارد.
در آزمایش هایی که اثر گیرنده های استروژنی بررسی می شود از محیط کشت بدون فنل رد استفاده می شود.
With phenol red
Without phenol red
L-glutamin:
یکی از منابع اصلی انرژی در سلول هایی است که به سرعت تکثیر می شوند و میزان انرژی کربوهیدرات در محیط کافی نیست.
محدودیت های آن عبارتند از ناپایداری در محلول , تجزیه آن به آمونیاک که برای سلول سمی است.
برای غلبه بر این مشکلات گلوتامین به فرم گلوتامات به محیط اضافه میشود.
L-Glutamin
Glutamin-Free
Stable Glutamin
محیط کشت DMEM+Glutamax:
Glutamax فرم L- Alanyl-L-glutamine است و مانع جمع شدن آمونیاک در سلول می شود.
محیط کشت IMDM:
فرم اصلاح یافته DMEM است و در مقایسه با آن مواد مغذی بیشتری دارد.
محیط کشت Non essential amino acid )MEM NEAA) :
این محیط کشت شامل هفت آمینو اسید غیر ضروری است که برای رشد بهینه سلول استفاده می شود.
اکثر سلولها اسیدهای امینه غیر ضروری را از طریق چرخه کربس و گلیکولیز تولید میکنند.
کاهش این امینو اسیدهای غیر ضروری در محیط کشت منجر به تولید فراورده های جانبی به دلیل مصرف بیشتر گلوکز و گلوتامین می گردد و در رشد سلول تاثیر میگذارد .
محیط کشت RPMI 1640 :
محیط کشت مناسب برای رشد سلولهای لنفوسیت و مونوسیت های خون محیطی است.
دارای میزان بالایی گلوتاتیون , ویتامین های بیوتین , B12 و aminobenzoic acid PABA است که در محیط های کشت DMEM و MEM وجود ندارد.
محیط کشت بسیار غنی شده برای تکثیر و تراکم بالای سلولها ست .
محیط کشت RPMI 1640 فرم اصلاح یافته DMEM است و در مقایسه با آن اسیدهای آمینه ، ویتامین ها و نمک های معدنی بیشتری دارد .
دارای نیترات پتاسیم به جای نیترات آهن و ترکیبات HEPES و سدیم پیروات است.
بافرهای آلی و غیر آلی: تنظیم بودن pH محیط کشت یکی از مهمترین فاکتورها در محیط برای رشد خوب سلولهاست. سلول ها در حین رشد مواد اسیدی متابولیکی از خود تولید میکنند که محیط را مناسب رشد باکتری مینماید ازین رو اضافه کردن بافرهای مناسب به محیط برای حفظ و کنترل pH محیط ضروری است.
یکی از بافرهای غیر آلی استفاده شده در محیط کشت ، بیکربنات سدیم است. این بافر ارزان بوده و معمولا برای حفظ محدوده بافری از آن استفاده میشود. زمانی که نیاز به pH بالاتر داشته باشیم یا بخواهیم pH محیط را ثابت نگه داریم از HEPES استفاده میشود که یک ماده آلی دوقطبی است و محدوده pH را بین 7.2 -7.6 نگه میدارد. البته لازم به ذکر است که برخی سلول ها نسبت به این ماده حساس میباشند ؛ بنابراین مقدار HEPES اضافه شده به محیط بسیار حایز اهمیت است.
سرم جنین گاوی: استفاده کردن از مکملهای رشد در محیط کشت در فراهم کردن فاکتورهای رشد و هورمونها ، خنثی کردن مواد سمی، حفاظت کردن سلول از استرس های فیزیکی و از بین رفتن آن موثر است.
سرم جنین گاوی از لحاظ دارا بودن فاکتوهای مناسب رشد بسیار غنی است که میتواند بین رشد و مرگ سلول تعادل ایجادکند. مبنع سرم جنین گاوی پلاسمای خون میباشد که به دلیل داشتن فاکتورهای رشد بیشتر و ایمنوگلوبین های کمتر نسبت به سایر مکملها مثل سرم گاو ، اسب و….رایج تر و البته گران تر میباشد.
آنتی بیوتیک ها: محیط کشت های سلولی بسیار مغذی هستند که بسیار مطلوب رشد انواع باکتری ها میباشند. به این دلیل عموما به محیط کشت های ساخته شده مقدار مشخصی آنتی بیوتیک ضد باکتری پنی سیلین و استرپتومایسین اضافه میشود که که با مهار تولید دیواره باکتری و پروتین سازی باعث از بین رفتن طیف وسیعی از باکتری های گرم مثبت و منفی میشوند. گاهی به دلیل گرم و مرطوب بودن فضای داخل انکوباتورها رشد قارچ دیده میشود که با انتی بیوتیک های ضد قارچ مانند آمفوتریسین B میتوان این مشکل را حل کرد.
فسفات بافر سالین: یا همان PBS که در کارهای مرتبط با کشت سلول با داشتن pH فیزیولوژیک، به عنوان یک بافر استاندارد جهت شستشوی سلولها و رقتسازی انواع محلولها استفاده میشود.
آنزیم تریپسین: برای جداکردن سلولها از هم در بافت یا از سطح ظرفی که کشت داده شده استفاده میشود
آگوست 31, 2020 | اخبار و مقالات
کشت سلولی چیست؟
کشت سلول (Cell Culture) به فرایند کشت یاختههای پروکاریوتی یا یوکاریوتی در یک محیط کشت گفته میشود.
برای بررسی کاربرد، فواید و جزئیات کشت سلولی با ما همراه باشید…
به فرآیندی که در آن سلول ها در شرایط خاص و کنترل شدهای بیرون از محیط طبیعی خود رشد داده شوند، کشت سلول (Cell Culture) گفته میشود.
در واقع کشت سلولی به فرآیند کشت یوکاریوتی در یک محیط کشت گفته میشود که شرایط کشت برای هر نوع سلول متفاوت بوده و باید برای رشد بهتر آن این شرایط مهیا شود؛ اما به طور کلی می توان گفت که محیط های مصنوعی باید حاوی مواد مغذی مانند ویتامین ها، مواد معدنی، قندها، آمینو اسیدها، هورمون ها و گازها باشد. در این محیط همچنین باید شرایط فیزیکی و شیمیایی تنظیم شده تا سلول ها بهتر رشد کنند. با توجه به تفاوت گونههای سلول ها، نوعی از این سلول ها برای رشد نیاز به یک سطح دارند که با آن متصل شده و برخی دیگر می توانند به صورت شناور در محیط کشت رشد و نمو کنند.
اصطلاح کشت سلول بیشتر در مورد کشت یاختههای جانداران چندسلولی کاربرد دارد. در این فرایند، سلولها خارج از محیط بیولوژیکی خود (in vitro) و تحت شرایط کنترلشده رشد داده میشوند. شرایط کشت سلولی برای هر گونه از جانداران و هر نوع سلول میتواند متفاوت باشد. محیط کشت، شامل ظرف کشت و یک ترکیب پایه است. مواد مغذی (مانند اسیدهای آمینه، کربوهیدراتها، ویتامینها و مواد معدنی)، فاکتورهای رشد و هورمونها بر حسب نیاز سلول به محیط کشت افزوده میشوند.
فرایند جداسازی و خالص سازی سلولها جهت انجام پروسه ی کشت، استخراج نام میگیرد. از جمله مهمترین آنزیمهای مورد استفاده در فرایند استخراج، میتوان به کلاژنازها، تریپسین یا پروتئاز اشاره کرد که ماتریکس خارج سلولی را میشکنند.
سلولهایی که بهطور مستقیم از خود فرد (هدف)، کشت داده میشوند بهعنوان سلولهای نسل اول (پرایمری) شناخته میشوند. اکثر کشتهای سلولی به جز آنهایی که از تومور گرفته میشوند، طول عمر محدودی دارند. یک رده سلولی نامیرا میتواند با ایجاد جهش تصادفی یا هدفمند (مانند بیان مصنوعی ژن تلومراز) بهطور نامحدودی تکثیر گردد و بهعنوان نمایندهای از انواع سلولی خاص پایهریزی شود.
محیط کشت باید نیازهای اولیه سلول را تا حدود معینی تأمین کند. سلولها در یک انکوباتور با دما و مخلوط گازی مناسب (بهطور معمول دمای ۳۷ درجه و %۵ دیاکسید کربن برای سلولهای جانوری) کشت داده میشوند. کشت یاختههای جانوری باید در محیط کاملاً استریل انجام شود؛ چون رشد یاختههای جانوری بسیار کندتر از رشد باکتریها و مخمرها است، امکان آلودگی وجود دارد. برای جلوگیری از رشد باکتریها گاهی از آنتیبیوتیکهایی مانند پنیسیلین، استرپتومایسین یا جنتامایسین استفاده میشود. محیطهای کشت اختصاصی برای رشد یاختههای مشخص نیز وجود دارد، مانند محیط کشتی که فقط یاختههای عصبی که تقسیم نمیشوند، میتوانند زنده بمانند.
برای اینکه یاختهها در محیط کشت بهخوبی تکثیر یابند، لازم است تراکم آنها در محیط کشت، در حد محدود و مشخصی باشد. برای این منظور باید هر چند وقت یکبار، یاختهها را به محیط کشتهای تازه جابجا کرد. در صورتیکه تراکم یاختهها بالا رود، بهعلت ممانعت تماسی، تکثیر یاختهها متوقف شده و یاختهها وارد مرحلهٔ تمایز سلولی میشوند.
تعدادی از سلولها مانند سلولهای موجود در جریان خون میتوانند بدون هیچ اتصالی به سطح، در سوسپانسیون رشد کنند. سلولهای چسبنده، برای رشد و تقسیم، باید به سطحی مانند پلاستیک کشت بافت یا ریزحاملها متصل شوند. این سطوح ممکن است به منظور افزایش قابلیت اتصال سلولها و فراهمسازی مواد لازم برای رشد و تمایز سلولی، با اجزای ماتریکس خارج سلولی آرایش یافته باشند.
پس از جداسازی بافت، ممکن است با مهاجرت سلولها از قطعات بافت متصل به بستر مناسب یا با تفکیک مکانیکی و آنزیمی بافت برای تولید یک سوسپانسیون سلولی، یک کشت اولیه به وجود آید که در نهایت تعدادی از سلولها به بستر خواهند چسبید. اکثر سلولهای تغییرنیافته و طبیعی مشتقشده از بافتهای جامد لازم است به یک سطح صاف چسبیده تا با حداکثر راندمان زنده مانده و تکثیر یابند. ازسوی دیگر سلولهای تغییریافته، مخصوصا سلولهای تومورهای جانوری قابل کشت، قادر به تکثیر به حالت معلق در محیط کشت می باشند.
اکثر سلولهای پرایمری پس از این که تا حد خاصی افزایش پیدا کردند، با حفظ ثبات سلولی تحت فرایند پیری قرار گرفته و تقسیم سلولی در آنها متوقف میشود.
کاربرد کشت یاخته، مطالعه ی تکوین جانداران است. اینکه چگونه یک سلول لقاح یافته می تواند به جانداری پرسلولی تبدیل شود که هر یک از سلول های آن از نظر مورفولوژی در زیر میکروسکوپ و خصوصیات دیگر با هم متفاوت باشند. برای پاسخ به این سوال می توان این سلول لقاح یافته را در محیط آزمایشگاهی کشت داد و مراحل مختلف کشت سلول را بر اساس تکامل و تمایز آن بررسی نمود. با کمک کشت سلولی می توان سلول هایی تهیه نمود که در مراحل مختلف تمایز قرار دارند و به کمک هورمون ها و فاکتورهای رشد می توانند به سلول های دیگری متمایز شوند. به کمک کشت سلولی می توان سلول های همسانی تهیه نمود و فعالیت های داخل سلولی از قبیل تکثیرDNA، سنتز نسخه برداری از DNA، سنتز RNA و پروتئین و سایر جزئیات مربوط به متابولیسم را مطالعه کرد. همچنین می توان پس از اتصال مولکول های مختلف به گیرنده غشایی مربوطه، اتفاقات بعدی و جریانات داخل سلولی از قبیل جابجایی این کمپلکس ها، نوع پیام های داخل سلولی و نحوه انتقال پیام ها را بررسی نمود سلول های کشت داده شده را می توان در دمای بسیار پایین به صورت منجمد نگهداری نمود. چنین شرایطی باعث حفظ سرعت رشد یا ترکیب ژنتیکی این سلول ها خواهد شد و در زمان مناسب دوباره می توان این سلول ها را ذوب نموده و استفاده کرد. بدین ترتیب از پیر شدن سلول ها جلوگیری می شود و این در حالی است که در حال حاضر امکان جلوگیری از پیری حیوانات وجود ندارد. هنگام کار با حیوانات آزمایشگاهی بایستی به تغییرات سیستمیک ناشی از تأثیر هموستاز طبیعی حیوان و یا استرس ناشی از آزمایشات روی نتایج توجه داشت. در حالیکه استفاده از کشت سلولی این مشکل را بطور کامل مرتفع می کند. علاوه بر این، استاندارد نمودن آزمون های آزمایشگاهی نسبت به آزمون های روی موجودات زنده ساده تر و عملی تر است، بطوریکه در محیط های آزمایشگاهی کنترل عوامل فیزیکی و شیمیایی محیط زندگی سلول ها شامل اسیدیته، حرارت، فشار اسمزی و فشار گازهایی نظیر اکسیژن و دی اکسید کربن بسیار ساده تر است.
سلولها میتوانند با چندین روش برای کشت آزمایشگاهی (ex vivo) جداسازی شوند. سلولها را میتوان به آسانی از خون استخراج و خالصسازی کرد. با این حال، تنها سلولهای سفید قادر هستند در محیط کشت رشد کنند. سلولهای تک هستهای میتوانند به وسیله هضم آنزیمی از بافتهای صاف آزاد شوند. از جمله مهمترین آنزیمهای مورد استفاده میتوان به کلاژناز، تریپسین یا پروناز اشاره کرد که ماتریکس خارج سلولی را میشکنند.
آخرین دیدگاهها